El objetivo del estudio de esta tesis doctoral fue la exploración de los mecanismos de resistencia y adaptación a radiación ultravioleta B (UVB) en microorganismos halófilos extremos. Por una parte, para aislar genes implicados en resistencia a radiación de estos microorganismos empleamos una técnica independiente de cultivo, la metagenómica funcional. Para ello, se construyeron dos bibliotecas metagenómicas, empleando a Escherichia coli como huésped, con ADN (metagenoma) extraído de salmueras de dos estanques cristalizadores de las salinas ¿Bras del Port¿ (Santa Pola, Alicante), denominados CR30 y CCAB (39% y 30% de sal respectivamente). Mediante el cribado funcional de las bibliotecas metagenómicas se aislaron ocho clones resistentes a radiación UVB. En los ocho fragmentos de ADN ambiental recuperados se identificaron quince genes de bacterias y arqueas responsables del fenotipo de resistencia a radiación UVB. Estos genes codifican para proteínas anteriormente identificadas en la resistencia al daño en el ADN, otras con función conocida pero no relacionadas con resistencia a radiación y varias proteínas con función desconocida, similares a familias de proteínas hipotéticas. Muchos de los genes también presentaron resistencia a 4-NQO, un compuesto que imita el daño en el ADN que produce la radiación UVB, por lo que esos genes podrían estar relacionados con protección o reparación del ADN; además, algunos de ellos también presentaron resistencia al compuesto tóxico perclorato. Por otra parte, para comprender como responde y se adapta la maquinaria celular de halófilos extremos a la radiación UVB, se realizó un estudio transcriptómico de la bacteria Salinibacter ruber y la arquea Haloquadratum walsbyi, para analizar los cambios de expresión génica después ser expuestos a una dosis subletal de radiación UVB y recuperarse en presencia de luz u oscuridad para Sal. ruber y sólo de luz para Hqr. walsbyi. En ambos microorganismos se observó la expresión diferencial de un porcentaje inferior al 20% de los genes…
Exploring the mechanisms of adaptation and resistance to UV radiation in extreme halophilic microorganisms
The objective of this doctoral thesis was to explore the mechanisms of resistance and adaptation to ultraviolet B radiation (UVB) in extreme halophiles. On one hand, to isolate genes involved in radiation resistance from these microorganisms, we used a culture-independent technique, functional metagenomics. For this, two metagenomic libraries were constructed, using Escherichia coli as host, with DNA (metagenome) extracted from brines of two crystallizing ponds from «Bras del Port» saltern (Santa Pola, Alicante), called CR30 and CCAB (39% and 30% salt respectively). Eight UVB resistant clones were isolated by functional screening of metagenomic libraries. In the eight environmental DNA fragments recovered, fifteen bacteria and archaea genes responsible for the phenotype of UVB resistance were identified. These genes encode for proteins previously identified in DNA damage resistance, others with known function but not related to radiation resistance, and several proteins with unknown function, similar to families of hypothetical proteins. Many of the genes also showed resistance to 4-NQO, a compound that mimics the DNA damage produced by UVB radiation, so these genes could be related to DNA protection or repair; furthermore, some of them also showed resistance to the toxic compound perchlorate. On the other hand, to understand how the cellular machinery of extreme halophiles responds and adapts to UVB radiation, a transcriptomic study of the bacteria Salinibacter ruber and the archaea Haloquadratum walsbyi was carried out, in order to analyze the changes in gene expression after being exposed to a sublethal dose of UVB radiation and recovered in the presence of light or darkness for Sal. ruber, and only light for Hqr. walsbyi. In both microorganisms, the differential expression of less than 20% of the genes was demonstrated….
